PCR技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的最新應(yīng)用進(jìn)
云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院王偉等擬文談到，隨著人們對(duì)食品安全性要求的不斷提高，PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)在食品檢測(cè)領(lǐng)域得以廣泛的應(yīng)用。
1 PCR的技術(shù)原理
根據(jù)已知的待擴(kuò)增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補(bǔ)的兩段寡核苷酸引物，在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增，這種方法也就是PCR技術(shù)。擴(kuò)增過(guò)程由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等3步反應(yīng)作為一個(gè)周期，反復(fù)循環(huán)，從而達(dá)到迅速擴(kuò)增特異性DNA的目的。高溫變性是在體外將含有需擴(kuò)增目的基因的模板雙鏈DNA經(jīng)高溫處理，分解成單鏈模板，低溫退火降低反應(yīng)系統(tǒng)溫度，使人工合成的寡聚核苷酸引物與目的DNA互補(bǔ)結(jié)合，形成部分雙鏈，適溫延伸是將反應(yīng)循環(huán)系統(tǒng)的溫度調(diào)至適溫，在TaqDNA聚合酶的作用下，有4種核苷酸存在時(shí)，引物鏈將沿著5′→3′方向延伸，形成與模板互補(bǔ)的新鏈，新鏈又可作為下一次反應(yīng)的模板，如此周而復(fù)始使目的基因的數(shù)量呈幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。
PCR技術(shù)檢測(cè)的主要步驟為：1運(yùn)用化學(xué)手段對(duì)目標(biāo)DNA提�。�2設(shè)計(jì)并合成引物，引物設(shè)計(jì)與合成的好壞直接決定PCR擴(kuò)增的成效，通常要求引物位于待分析基因組中的高度保守區(qū)域，長(zhǎng)度為15～30個(gè)堿基為宜；3進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4克隆并篩選鑒定PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，在紫外光照射下可見(jiàn)擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶，根據(jù)該帶的不同即可鑒定不同的DNA；5DNA序列分析。
不同的對(duì)象如擴(kuò)增DNA片斷序列全知、半知或未知，其PCR參數(shù)、退火溫度、時(shí)間、引物等都有較大的差別，將RFLP、Sequence、反轉(zhuǎn)錄PCR等技術(shù)相結(jié)合，形成了眾多的衍生技術(shù)，如多重PCR，定量PCR，競(jìng)爭(zhēng)PCR單鏈構(gòu)型多態(tài)性PCR，巢式PCR等。這些技術(shù)的產(chǎn)生將使PCR技術(shù)在食品中的應(yīng)用潛力更加廣泛。
2 PCR技術(shù)在檢測(cè)食品中有害微生物的應(yīng)用
2.1 檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌
沙門(mén)氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的人畜共患病之一，病原屬腸桿菌科，蛋、家畜和肉制品等都是主要的傳播媒介。1993年Song等人利用PCR技術(shù)成功的檢測(cè)到血液中的傷寒沙門(mén)氏菌DNA。1994年盧強(qiáng)等參考Rahn設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增了invA基因284bp的特異片段。
近年來(lái)，用PCR技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌得到了迅速發(fā)展，產(chǎn)生了許多種PCR法，如常規(guī)PCR、套式PCR、多重PCR。也可幾種方法結(jié)合使用，如李君文等將常規(guī)PCR與半套式PCR相結(jié)合，根據(jù)沙門(mén)氏菌中保守的165rRNA基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)了一對(duì)引物，擴(kuò)增的片段為555bp。經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)反應(yīng)條件，只對(duì)沙門(mén)氏菌產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，敏感性達(dá)30cfu。為了對(duì)擴(kuò)增強(qiáng)果進(jìn)行鑒定，又在這兩條引物之間設(shè)計(jì)一條半套式引物。經(jīng)半套式PCR檢測(cè)下明第一次的產(chǎn)物是正確的，且靈敏度提高至3cfu。此外，還可將PCR與微孔板檢測(cè)、ELISA技術(shù)以及探針雜交有機(jī)結(jié)合起來(lái)。
2.2 檢測(cè)食品中的大腸桿菌
在大腸桿菌檢測(cè)中，主要的檢測(cè)目標(biāo)是腸出血性大腸桿菌和腸毒素大腸桿菌兩種。腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichiacoli,EHEC)是指能夠引起人類出血性腸炎的一類大腸桿菌，主要經(jīng)口傳播。該菌引起的食物中毒首先在美國(guó)于1982年爆發(fā)，之后在世界各地相繼發(fā)現(xiàn)病例。盧林耿等在2001年進(jìn)行的調(diào)查表明，我國(guó)的食品中也存在散發(fā)E.Coli0157的菌株。
王靜等經(jīng)過(guò)研究建立了一種快速檢測(cè)食品中腸出血性大腸桿菌(EHEC)的多重PCR方法，將樣品增菌后，采用快速裂解吸附法制備模板，用多重PCR同時(shí)檢測(cè)EHEC的3種毒力基因eaeA、hlyAB、slt1/2，相應(yīng)擴(kuò)增片段依次為1109、302、228bp。檢測(cè)了60株大腸桿菌和其它菌種：結(jié)果12株大腸桿菌0157：H7、1株大腸桿菌026：H11和1株大腸桿菌0111：H8，同進(jìn)檢出上述3種基因，2株EAEC檢出了eaeA基因，1株VTEC檢出了s1t1/2基因，其余43株大腸桿菌和非大腸桿菌未檢出上述基因。檢測(cè)食品中EHEC時(shí)，從樣品增菌培養(yǎng)到整個(gè)檢測(cè)過(guò)程結(jié)束不超過(guò)8小時(shí)，方法的檢出限≤1.6 cfu/g(mL)。檢測(cè)的126份食品樣品中，3份檢出了EHEC(包括牛肉、豬肉和生菜各1份)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該法是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)、省力的EHEC檢測(cè)方法。
腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起嬰幼兒腹瀉的主要原因，也是導(dǎo)致“旅行者”腹瀉的重要原因。王嘉福等(1997)用自己設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物，對(duì)食品中的大腸桿菌(ETEC)的熱敏性毒素(LT)基因和耐熱性毒素(ST)基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出來(lái)的314bp和237bp DNA片段均能與相應(yīng)的基因探針雜交，可以檢測(cè)出3種毒素基因型(LT、ST及LTST)的ETEC，具有快速和靈敏度高的特點(diǎn)。
2.3 檢測(cè)肉毒梭狀芽孢桿菌
肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素，在天然物質(zhì)中毒力最強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，Nooki根據(jù)毒素A基因的非重復(fù)區(qū)段設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物(NK1－NK2和NK3－NK2)分別用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為546bp和252bp的特異片段；又根據(jù)毒素A基因的重復(fù)區(qū)段序列，設(shè)計(jì)了另外一對(duì)引物NK11－NK9，用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為1266bp的特異片段。此三對(duì)引物都能快速、特異地從肉食品樣品中檢測(cè)出肉毒梭狀芽孢桿菌。
2.4 檢測(cè)金黃色葡萄球菌
金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)可引起人類食物中毒，其內(nèi)毒素——中毒休克綜合癥毒素(TssT1)可引起中毒休克綜合癥，產(chǎn)生的脫皮毒素(ETA、ETB)與一系列膿疤性葡萄球菌感染有關(guān)。Johenson等(1990)建立了檢測(cè)上述毒素基因的PCR技術(shù)，可在較短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出葡萄球菌毒株，并且具有極高的特異性和敏感性。
2.5 檢測(cè)單核細(xì)胞增多癥李斯特氏桿菌
李斯特氏桿菌廣泛存在于自然界當(dāng)中，是影響食品衛(wèi)生的重要病原菌。有資料顯示，在其傳播途徑中，動(dòng)物性食品為主要傳染源。研究資料表明，李斯特氏桿菌的致病性由2個(gè)重要致病因素引起：李氏溶血素O和侵襲因子內(nèi)化素，無(wú)李氏溶血素O的李氏桿菌不致病。王芳等采用ERIC－PCR方法，根據(jù)是否可以擴(kuò)增獲得1600bp的DNA片段，作為鑒定單增李氏菌依據(jù)，并與國(guó)標(biāo)鑒定方法進(jìn)行對(duì)比，以確定ERIC－PCR方法的可靠性。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種鑒定方法獲得的結(jié)果完全一致，這證明ERIC－PCR方法鑒定單增李氏菌具有可行性。
3 PCR技術(shù)在檢測(cè)食品中轉(zhuǎn)基因成分的應(yīng)用
目前植物性轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)采用的技術(shù)路線有兩條：一是檢測(cè)插入的外源基因，主要應(yīng)用PCR法、Northern雜交及Southern雜交；二是檢測(cè)表達(dá)的重組蛋白，主要采用ELISA法、Western雜交及生物學(xué)活性檢測(cè)。PCR技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，其敏感快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)是其它檢測(cè)技術(shù)所無(wú)法比擬的。
劉光明等根據(jù)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中常用的花椰菜葉病毒啟動(dòng)子(CaMV 35S)和根癌農(nóng)桿菌終止子(NOS)的序列，設(shè)計(jì)并合成了兩對(duì)不同的引物和相對(duì)應(yīng)的兩種熒光雙鏈探針(FDCP)，分別建立了常規(guī)PCR、應(yīng)用FDCP的新型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分35S啟動(dòng)子和NOS終止子的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種PCR方法均能有效檢測(cè)出35S和NOS片段，其中常規(guī)PCR方法具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)；應(yīng)用FDCP的新型實(shí)時(shí)熒光PCR方法則更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。
曹際娟等應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因(GM)玉米及其粗加工食品如：爆玉米花、熱玉米棒、速溶玉米片中通常轉(zhuǎn)入的基因構(gòu)建元件35S啟動(dòng)子、NOS終止子和外源抗蟲(chóng)GryLA(b)目的基因進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)GM玉米的檢測(cè)低限可達(dá)到0.1％。
4 PCR技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用展望
PCR技術(shù)在食品檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、高效等特點(diǎn)，為食品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持。但是，PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也表現(xiàn)出一些缺陷，例如容易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性，產(chǎn)物容易突變，不能檢測(cè)致毒微生物產(chǎn)生的毒素等。
隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和各項(xiàng)新技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，以及今后專門(mén)針對(duì)如何控制外源DNA的污染、如何控制突變和如何利用PCR技術(shù)鑒別致毒微生物產(chǎn)生的毒素等方面的深入研究，必將為PCR技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域更加廣泛的應(yīng)用提供新的思路。中國(guó)糧油儀器網(wǎng) http://m.web-tv.com.cn
