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植物葉片是吸收陽(yáng)光的場(chǎng)所，而葉片中葉綠素的含量高低，又決定了光合速率。植物葉片中葉綠素含量高，則光合作用更加快速，植物營(yíng)養(yǎng)狀況更加全面。事實(shí)上，通常我們測(cè)定測(cè)定葉綠素含量以表征植物生長(zhǎng)狀況, 也往往把葉色變化作為看苗診斷和肥水管理的重要指標(biāo)。而測(cè)定植物葉綠素含量又有幾種方法：分光光度法、葉綠素測(cè)定儀、光聲光譜法等。分光光度法是應(yīng)用最為廣泛的一種方法，但同為分光光度法，也有不同的試劑作為溶劑，使的葉綠素含量的測(cè)定結(jié)果有少許差異。本文主要講解下用丙酮-乙醇混合法提取葉綠素。

具體實(shí)驗(yàn)操作：

1.儀器與試劑：分光光度計(jì)、高度電動(dòng)勻漿器、電子天平；珊瑚樹(shù)嫩葉、95% 丙酮-乙醇、95%乙醇和80%丙酮。（如果需要作對(duì)比實(shí)驗(yàn)，可以使用葉綠素含量測(cè)定儀或者SPAD502葉綠素儀來(lái)進(jìn)行測(cè)定，）

2.實(shí)驗(yàn)方法：葉綠素的提取: 將材料去脈剪碎(約1—2mm 見(jiàn)方) , 隨機(jī)取樣, 準(zhǔn)確稱(chēng)重取015g (精確到0.1mg) , 放入50mL 比色管中, 分別加入上述三種提取液25mL; 另稱(chēng)0.5g 樣品, 加6mL 雙蒸水和少量CaCO3, 勻漿, 定容至25mL , 過(guò)濾, 取2.25mL 濾液放入50mL 比色管中, 加23.75mL 丙酮-乙醇(2∶1) , 使之成為95% 丙酮2乙醇勻槳提取液。比色管加塞放置于25℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)暗中提取葉綠素。每種提取方法重復(fù)3 次。

葉綠素提取液吸收光譜的測(cè)定: 用分光光度計(jì)在600—700nm 范圍內(nèi)對(duì)不同葉綠素提取液進(jìn)行掃描, 波長(zhǎng)精度為0.2nm。

葉綠素含量測(cè)定: 分別以提取溶劑作空白, 測(cè)定葉綠素提取液吸光度A 645、A 663, 利用A rnon 公式:

葉綠素a 濃度(mgöL ) : Ca= 12. 7A 663- 2. 69A 645;

葉綠素b 濃度(mgöL ) : Cb= 22. 9A 645- 4. 68A 663;

葉綠素總濃度(mgöL ) : Ca+ b= Ca+ Cb。

計(jì)算提取液中葉綠素濃度, 換算為每克鮮葉葉綠素含量(mg/g 鮮重)。

3.結(jié)果與討論

（1）葉綠素提取液的吸收光譜：4 種葉綠素提取液的吸收光譜在600—700nm 范圍內(nèi)基本相似, 說(shuō)明4 種葉綠素提取液的光吸收性質(zhì)基本相似, 可以用A rnon 公式進(jìn)行葉綠素含量的計(jì)算。

（2）不同提取溶劑對(duì)葉綠素提取總量的影響：不同提取溶劑對(duì)葉綠素提取總量有著明顯的影響(表1) , 95% 丙酮2乙醇提取的葉綠素總量最高, 高于傳統(tǒng)的80% 丙酮提取法29.5% ,95% 乙醇提取的葉綠素總量亦比80% 丙酮法高9.5%。95% 丙酮2乙醇提取葉片勻漿的葉綠素總量與提取葉片碎片的葉綠素總量沒(méi)有顯著差異。

（3）不同提取溶劑提取葉綠素的進(jìn)程：不同提取溶劑提取葉綠素速度差異較大, 提取完全程度也不同。提取速度最快的是95%丙酮2乙醇, 葉綠素經(jīng)過(guò)8h 已經(jīng)基本提取完全, 葉片碎片變白; 其次是95% 乙醇, 而80% 丙酮提取速度最慢, 后兩者在24h 內(nèi)沒(méi)有完全提取出葉綠素。從提取速度來(lái)看, 95% 丙酮2乙醇要優(yōu)于95%乙醇和80% 丙酮。葉片勻漿后用95% 丙酮2乙醇在0.5h 就已經(jīng)提取完全, 大大加快了葉綠素提取速度。

（4）不同提取液中葉綠素的穩(wěn)定性：用不同提取溶劑提取珊瑚樹(shù)葉片葉綠素, 在25℃生化培養(yǎng)箱中暗中放置0、3、6 天后測(cè)定提取液中葉綠素含量, 結(jié)果見(jiàn)表2。葉綠素提取液放置6 天后, 葉綠素a 下降了5.8% —11.9% , 葉綠素b下降了2.7% —7.4% , 葉綠素總量下降了4.9% —10.5%。這些都說(shuō)明, 在這些提取液中, 葉綠素b比葉綠素a 穩(wěn)定。葉綠素提取液中葉綠素a、葉綠素b 的含量、穩(wěn)定性與提取材料、提取液性質(zhì)和提取液含水量有關(guān)。為了提高葉綠素提取液的穩(wěn)定性, 可通過(guò)降低提取液中的含水量來(lái)實(shí)現(xiàn)。但若所用的材料是干粉, 提取液中最好含有適量的水分, 使葉綠素分子中親水的基因易與蛋白質(zhì)分離,利于葉綠素從類(lèi)囊體膜中游離出來(lái)。有些學(xué)者曾采用比傳統(tǒng)丙酮法含水量更低的丙酮提取液提取鮮葉葉綠素, 效果較好。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 葉綠素在不同提取液中穩(wěn)定性的大小依次為: 95% 丙酮2乙醇> 95%乙醇> 80%丙酮。

（5）精密度實(shí)驗(yàn)：95% 丙酮-乙醇提取效果好, 提取速度快, 具有較高的精密度。

4.結(jié)論

分光光度法測(cè)定植物葉片葉綠素含量, 由于所用提取溶劑不同, 測(cè)定結(jié)果差異顯著。一種好的提取溶劑應(yīng)該提取速度快, 葉綠素得率高, 穩(wěn)定性好, 測(cè)定結(jié)果精密度高, 吸收光譜與傳統(tǒng)丙酮法一致, 能用A rnon 公式計(jì)算葉綠素含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 95% 丙酮2乙醇法具有上述特點(diǎn), 是一種較好的葉綠素提取溶劑, 而傳統(tǒng)的80% 丙酮法和95% 乙醇法提取葉綠素速度慢, 提取不完全, 應(yīng)慎用。葉片經(jīng)勻漿后再用丙酮2乙醇提取, 葉綠素得率與葉片浸泡法相似, 但大大提高了提取速度, 這對(duì)于快速測(cè)定大量樣品葉綠素含量具有實(shí)際意義。