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食品種類很多,食品中pro 的性質(zhì)和含量各不相同,而且其他成分,如碳水化合物,脂肪和維生素的干擾成分很多,因此pro 的測(cè)定通常利用經(jīng)典的凱氏定氮法將樣品消化成銨鹽蒸餾,用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收,用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定,由樣品中含氮量計(jì)算出pro 的含量。由于食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它們的基本原理都是一樣的。我們?cè)跈z驗(yàn)食品中pro 時(shí),往往只限于測(cè)定總氮量,然后乘以pro 核算等數(shù),得到蛋白質(zhì)含量,實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物,故稱為粗pro 。

不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的,首先第一個(gè)步驟是消化:樣品與硫酸一起加熱消化,硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物,使有機(jī)物中的C、H 氧化為CO2 和H2O 蒸汽逸出,而pro 則分解氮,則與硫酸結(jié)合成硫酸銨,留在酸性溶液中。在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解,它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀,可提高反應(yīng)溫度,一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330 ℃,而添加硫酸鉀后,溫度可達(dá)400 ℃,加速了整個(gè)反應(yīng)過程。此外,也可以加入硫酸鈉,氫化鉀鹽類來提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解,水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大,沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大,否則溫度太高,生成的硫酸氫銨也會(huì)分解,放出氨而造成損失。

為了加速反應(yīng)過程,還加入硫酸銅,氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫,次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。所以有機(jī)物全部消化后,出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色,它具有催化功能,還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。使用儀器推薦：消化爐或者全自動(dòng)定氮儀。

1.1 　蒸餾

樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨,在這操作中,一是加入氫氧化鈉溶液要過量,二是要防止樣液中氨氣逸出。吸收與滴定:蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收,然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液,從而計(jì)算出總氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng),它有吸收氨的作用。

1.2 　操作步驟

準(zhǔn)確稱取樣品中(0.50～2.00) g →于500ml 凱氏瓶中→加10g 無水K2SO4 →加0.5gCuSO4 →加20mlH2SO4 →在通風(fēng)櫥中先以小火加熱,待泡沫消失后,加大火力,消化至透明無黑粒后,將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續(xù)消化30 分鐘→至到樣液呈綠色狀態(tài),停止消化,冷卻→加200ml 水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在K 氏瓶中加波動(dòng)珠數(shù)粒和80ml50 %NaOH →立即接好定氮球→加熱→至到K氏瓶?jī)?nèi)殘液減少到三分之一時(shí),取出用水沖洗→用0.1N HCl 滴定。

計(jì)算:總氮量% = ( N ( V2 - V1) ×0.014) / W ×100

0.014 ———氮的毫克當(dāng)量數(shù)

pro % = 總氮% ×K

乳制品K = 6.38 ( N = 15.7 %)

小麥粉K = 5.79 ( N = 17.6 %)

動(dòng)物膠K = 5.6 ( N = 18.0 %)

冰蛋K = 6.7 ( N = 14.8 %)

大豆制品K = 6.0 ( 16.7 %) 　K = 6.25 則( N =16 %)

K - 換稱等數(shù)

1.3 　各種試劑的作用

濃H2SO4 : (1) 脫水使有機(jī)物炭化,然后有機(jī)物炭化生成碳,碳將H2SO4 還原為SO2 ,本身則變?yōu)镃O2 。(2)氧化。(3) pro 與濃H2SO4 生成NH3 ↑,CO2 , SO2 , H2O↑。(4) NH3 與H2SO4 生成硫酸銨。

CuSO4 :催化劑,CuSO4 為紅色沉淀,當(dāng)C 完全消化后,反應(yīng)停止,紅色消失,變?yōu)樘m色,即為消化達(dá)到完全,蘭色為CuSO4 的顏色。K2SO4 :提高沸點(diǎn),沸點(diǎn)由330 ℃提高到400 ℃加速了反應(yīng)過程。

下面就幾方面來說明影響氨化完全與否和速度快慢的因素:

(1) K氏燒瓶和取樣量

如果稱1g 以上的樣品, 就需要K 氏燒瓶最小500ml , (800～1000) ml 的更好,這樣的K 氏燒瓶對(duì)于縮短氨化時(shí)間,加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

(2) 分解劑

H2SO4 和K2SO4 的添加量。有機(jī)無分解需要H2SO4 量,H2SO4 應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同,如果試樣含脂類高,則加H2SO4 多,為了提高分解溫度,要大量添加K2SO4 ,但不能太多,也不能太少,太少則氨化不充分。K2SO4 和H2SO4 的添加比例是:1g 樣品　K2SO4 : H2SO4 = 7g :12ml這種比例在國(guó)內(nèi)外都使用,是公認(rèn)的還有一種比例: K2SO4 :H2SO4 = 10 :20ml

(3) 催化劑

用作催化劑的有Hg、HgO、Se , 硒化合物, CuSO4 、TiO2 ,對(duì)Hg ,HgO 有毒但結(jié)果好,Se 與CuSO4 得到結(jié)果是一種,TiO2 ,的結(jié)果偏低,采用不同的催化劑則消化時(shí)間不同, HgO 消化麥子為38 ,Se 與CuSO4 消化麥子55 ,TiO2 消化麥子70 ,所以在給出測(cè)定結(jié)果時(shí)要注明催化劑的類型。

(4) 熱源的強(qiáng)度

消化時(shí)熱源的強(qiáng)度同迅速消化和完全氨化關(guān)系很大,即便鹽類K2SO4 加得多,如果熱源弱,也是沒有意義的,熱源過強(qiáng)導(dǎo)致H2SO4 損失,使氨回收率低,另外K氏瓶的容量大小,頸部的粗細(xì)和長(zhǎng)短等,也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。

(5) 氨的蒸餾和吸收及滴定

蒸餾有兩種:直接蒸餾(裝置簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性好) 和水蒸汽蒸餾。蒸餾加NaOH 是50 % ,加的量為H2SO4 量的4倍,硫酸量為12ml ,則NaOH 為12 ×4 = 48ml ,而且一般高于這個(gè)理論值,即加到(50～55) ml ,如果NaOH 量加的不夠就變成H2S , H2S 是強(qiáng)酸,使顏色變紅。吸收液有:標(biāo)準(zhǔn)H2SO4 ,用標(biāo)準(zhǔn)堿返滴定,甲醛紅指示劑;硼酸,用HCl 進(jìn)行滴定,混合指示劑。目前都用硼酸吸收液,用硼酸代替H2SO4 ,這樣可省略了反滴定, H2SO4 是強(qiáng)酸,要求較嚴(yán),而硼酸是弱酸,在滴定時(shí),不影響指示劑變色范圍,另外硼酸為吸收液濃度在3 %以上可將氨完全吸收,為保險(xiǎn)期間一般用4 %。

1.4 　實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1) 樣品應(yīng)是均勻的,若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì),液體樣要混合均勻。

(2) 樣品放入K氏燒瓶時(shí),不要黏附瓶頸上,萬一黏附可用少量水緩慢沖下,以免被檢樣消化不完全,使結(jié)果偏低。

(3) 消化時(shí),如不容易呈透明溶液,可將K氏燒瓶放冷后,加入30 %過氧化氫催化劑(2～3) ml ,促使氧化。

(4) 在整個(gè)消化過程中,不要用強(qiáng)火,保持和緩的沸騰,使火力集中在K 氏燒瓶底部,以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下,使氮有損失。

(5) 如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失,這時(shí)會(huì)形成硫酸氫鉀,而不與氨作用,因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時(shí),要添加硫酸量。

(6) 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色,如果沒有溴甲酚綠,可單獨(dú)使用011 %甲醛紅乙醇溶液。

(7) 氨是否完全蒸餾出來,pH 試紙檢查餾出液是否為堿性。

(8) 向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí),往往出現(xiàn)褐色沉淀無。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng),生成氫氧化銅,經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀,有時(shí)Cu 離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。

(9) 消化劑綠色后繼續(xù)消化30min 即可。

二者原理相同,操作方法大同小異,半微量法消化后,定容100ml ,然后吸25ml 蒸餾吸收液吸收。計(jì)算總氮% = ( N ( V 2 - V 1 ) ×01014) / ( W ×10/100) ×100

對(duì)于微量定氮儀法,儀器有了改進(jìn),樣液稱樣少,蒸餾消化液也少,其它基本一樣。

原理與上面一樣,儀器,采用凱氏定氮儀其裝置內(nèi)具有自動(dòng)加堿蒸餾裝置,自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置,消化裝置:由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的K 氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。